PCR-võimendussimulaator

Vaata, kuidas DNA koopiad kasvavad eksponentsiaalselt PCR-tsüklite jooksul. Leia Ct läviväärtuse tsükkel.

Näidisarvutus — PCR-võimendussimulaator

Lõplikud koopiad	1.07 × 10⁹
Võimenduse kordsus	1.07 × 10⁹×
Ct	27
Valem	1 × (1+1)n

Need on väärtused, mida kalkulaator lehe avamisel näitab. Muuda ülal mõnda sisendit, et need ümber arvutada.

Interaktiivse simulatsiooni laadimine...

C_t muudab korrutamise lahutamiseks 🖖

Graafiku püsttelg on logaritmiline, nii et selle tööriista puhas eksponentkasv joonistab sirge — ja just see teeb C_t näidu üldse väärtuslikuks. C_t on tsükkel, kus kõver ületab sinu läve, nii et lähtematerjali kordistamine nihutab kogu sirget külgsuunas, muutmata selle tõusu. Iga kümnekordne muutus C₀-s nihutab C_t väärtust ln 10 / ln(1+e) tsükli võrra: 3,32 täiusliku efektiivsuse juures, 3,59 kui e = 0,9. Laadi kliiniline eelseade ja liiguta C₀ väärtuselt 10 väärtusele 100 ja siis 1000 — C_t langeb 18, 15, 11. Kontsentratsiooni tagurpidi lugemine sellest nihkest on kogu kvantitatiivse PCR alus.

Mitte päris kahekordistumine igas tsüklis 🖖

PCR töötab nagu molekulaarne koopiamasin: iga tsükkel püüab kahekordistada iga DNA ahela katsutis. Ükski ensüüm ei kopeeri aga iga matriitsi täiuslikult, seega määrab efektiivsus e tegeliku tsüklikordaja (1 + e) — 2.0 täiusliku puhul, ehk 1.9 juures 90%. Langeta tööriistas efektiivsust ja vaata, kuidas see väike puudujääk ringi kohta kuhjub: 30 tsükli jooksul kasvab vahe 1.9× ja 2.0× vahel miljoniteks puuduvateks koopiateks.

Miks PCR vajas Yellowstone'i mikroobi 🖖

Iga tsükkel kuumutab katsuti umbes 95°C-ni, et kaks DNA ahelat lahti kiskuda — piisavalt kuum, et tavaline polümeraas hävitada. Varajane PCR oli piinarikas: tehnikud lisasid pipetiga värsket ensüümi käsitsi pärast iga tsüklit. Pääste tuli bakterilt Thermus aquaticus, mis elab Yellowstone'i peaaegu keevates allikates ja mille Taq polümeraas kuumust ei karda — nii kulgeb kogu reaktsioon puutumatult ühes masinas.

Ülesanne täielikult lahendatud

Kolmkümmend täiusliku efektiivsusega PCR-tsüklit, mis muudavad ühe molekuli miljardiks 5 sammu
Kolmkümmend PCR-tsüklit täiusliku efektiivsuse juures muudavad ühe molekuli miljardiks. Tuleta see ning seejärel leia, mida läheb maksma efektiivsuse 5%-line langus — vastus ei ole 5%.
1. Iga tsükkel kopeerib iga olemasoleva ahela, seega korrutub populatsioon teguriga 1 + e. Täiuslik efektiivsus tähendab e = 1 ja otsest kahekordistumist.
  
  $C_{n} = C_{0} (1 + e)^{n} = 1 \times 2^{30} = 1.07 \times 1 0^{9}$
2. Kolmkümmend kahekordistumist on 2³⁰ ehk umbes 1,07 miljardit ühest ainukesest algmolekulist. See on kogu põhjus, miks PCR töötab: liiga väike kogus tuvastamiseks muutub ühe pärastlõunaga liiga suureks, et seda märkamata jätta.
3. Künnistsükkel pöörab sama seose ümber — see on tsükkel, mille juures kogus ületab esmakordselt tuvastusläve. See on logaritm, mistõttu võrreldakse C_t väärtusi lahutades ja miks üks tsükkel tähendab kahekordset tegurit.
  
  $C_{0} (1 + e)^{C_{t}} = 1 0^{8} ⟹ C_{t} = lo g_{2} 1 0^{8} = 26.58 \to 27$
4. Nüüd langeta efektiivsust väärtuseni 0,95, nii et iga tsükkel korrutub 1,95-ga 2 asemel. Pärast kolmekümmet tsüklit on see 5,02 × 10⁸.
  
  $e = 0.95 : 1.9 5^{30} = 5.02 \times 1 0^{8}$
5. Suhe on (2/1,95)³⁰ — tsükli kohta 2,5%-line puudujääk, mis liitub kolmkümmend korda.
  
  $\frac{2 ^{30}}{1.9 5 ^{30}} = (\frac{2}{1.95})^{30} = 2.14$
Vastus

Tööriist kuvab 1,07 × 10⁹ koopiat ja C_t = 27. Efektiivsuse 5%-line kadu läheb maksma teguri 2,14 võrra, mis on rohkem kui pool saagikusest, sest kadu korrutatakse kolmkümmend korda, mitte ei liideta ühte korda. See on kvantitatiivse PCR-i põhiraskus: näit on eksponentsiaalne suurusest — efektiivsusest —, mis varieerub reaktsioonide vahel sõltuvalt praimeri disainist, maatriksi puhtusest ja seadme enda termilisest ühtlusest. Seetõttu tehakse qPCR alati standardkõvera suhtes, mitte ei usaldata seda absoluutse loendina, ja miks üksainus inhibiitor proovis võib välja näha täpselt nagu väiksem algmaterjali kogus.

$C_{n} = C_{0} (1 + e)^{n} : e = 1 \Rightarrow 1.07 \times 1 0^{9}, e = 0.95 \Rightarrow 2.14 \times fewer$

Allikad (3)

Cₜ, amplification efficiency and how the two are reported: S. A. Bustin et al., "The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments." Clinical Chemistry 55(4), 611–622, 2009.
The real-time kinetic measurement the Cₜ readout models: R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger and R. Watson, "Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions." Nature Biotechnology 11(9), 1026–1030, 1993.
The thermostable polymerase named in the third block: R. K. Saiki et al., "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 239(4839), 487–491, 1988.

42Mathi meeskond · Uuendatud 2026-06-24

Kontrollitud avaldatud allikate põhjal. Parandused on teretulnud. Toimetamispõhimõtted · Parandused

Kõik Bio, geo ja keemia õppetunnid →

Näiteülesanded

Ideaalne (e=1) - Kolmkümmend kahekordistumist ühest molekulist: 1,07 × 10⁹ koopiat, kusjuures 10⁸ lävend ületatakse 27. tsüklis. See võtabki kokku kogu PCR-i olemuse antud eelseadistuses. Neis arvudes pole mingit keemiat, kõik on puhtalt 2³⁰.
95% efektiivne - Langetades efektiivsust 1-lt 0,95-le, annavad samad kolmkümmend tsüklit 1,07 × 10⁹ asemel tulemuseks 5,02 × 10⁸. Viis protsenti tsükli kohta läheb kolmkümmend korda kuhjudes maksma poole saagisest. Lävend nihkub sealjuures vaid ühe tsükli võrra, 27-lt 28-le. See ongi põhjus, miks qPCR esitab Ct-väärtuse, mitte saagise.
Kliiniline - Kümme algkoopiat 90% efektiivsusega neljakümne tsükli vältel: 1,41 × 10¹² koopiat, Ct 18. Pange tähele, et kordistustegur on 1,41 × 10¹¹. See on koopiate arvust kümme korda väiksem, kuna seda arvutatakse teie kümne algmolekuli, mitte ühe suhtes.
Madal efektiivsus - Sada algkoopiat, kuid efektiivsus vaid 85%: 2,24 × 10¹¹ koopiat pärast kolmekümne viit tsüklit, Ct 19. Matriitsi on kliinilise eelseadistusega võrreldes kümme korda enam, ent lävend saabub ikkagi tsükli jagu hiljem. Lävend ise on samuti kümme korda kõrgem ja iga tsükkel kordistab 1,9 asemel arvuga 1,85.

PCR-võimendussimulaator

Ct muudab korrutamise lahutamiseks 🖖

Mitte päris kahekordistumine igas tsüklis 🖖

Miks PCR vajas Yellowstone'i mikroobi 🖖

Näiteülesanded

C_t muudab korrutamise lahutamiseks 🖖