ミカエリス・メンテン反応速度論

ミカエリス・メンテン式で酵素反応速度をモデル化し、阻害効果を比較します。

計算例 — ミカエリス・メンテン反応速度論

見かけの Vmax	100.00
見かけの Km	5.00
グラフの種類 V vs [S] ラインウィーバー・バーク	5.0[S]V

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飽和は漸近的で、しかも情け容赦なく遅い 🖖

曲線は V_max に近づきますが決して到達しません。その遅さの算数を手元に置いておく価値があります。v/V_max = [S]/(K_m + [S]) なので、速度を半分にするには基質がちょうど K_m 一つ分必要です。90% には九つ分、99% には九十九つ分かかります。ツールで [S] を K_m に合わせれば 0.5·V_max と読めます。[S] を百倍しても、まだ天井には触れていません。だからこそ V_max は直接測定できないのです。実測値ではなくフィッティングから読み取る量であり、次のブロックの逆数プロットが考案された理由そのものです。

曲線をまっすぐにして読み取る 🖖

このツールのラインウィーバー・バークプロットは式を 1/v = (K_m/V_max)(1/[S]) + 1/V_max に変形し、湾曲した飽和曲線を直線に変えます。曲線フィッティングのソフトがなかった時代、これにより直線を定規で延長して定数を直接読み取れました。y切片が 1/V_max、x切片が -1/K_m を与えます。難点は、逆数が巨大になる低 [S] の点がフィットを支配し、測定誤差を過大に見せてしまうことです。

同じ曲線はいたるところに潜む 🖖

この直角双曲線は酵素だけのものではありません。まったく同じ形が、表面に付着する気体分子のラングミュアの吸着等温式、栄養供給に対する微生物増殖のモノーの式、ヘモグロビンへの酸素結合のヒルの式として現れます。決まった数の結合部位が徐々に飽和する系はどれもこの形をとるため、V_max と K_m を求めることは、最大容量と半飽和点を求めることに等しいのです。

全プロセスの詳細解説

V max = 100 および K m = 5 の酵素 5 ステップ
V_max = 100 および K_m = 5 の酵素。K_m が実際に何を測定しているかを示し、最大速度の 10% から 90% に達するのに必要な基質濃度を求めよ。
1. 反応速度式は飽和曲線を描く。基質が少ないときは基質濃度に比例し、十分にあるときは平坦になる。その移行がどこで起きるかを決定する唯一の要素が K_m である。
  
  $v = \frac{V _{m a x} [ S ]}{K _{m} + [ S ]}$
2. [S] を K_m に等しく置くと、数式は単純化される。K_m は半飽和濃度であり、反応速度でも結合エネルギーでもなく、曲線の平坦な部分から読み取れる性質でもない。
  
  $[S] = K_{m} ⟹ v = \frac{V _{m a x} K _{m}}{2 K _{m}} = \frac{V _{m a x}}{2} = 50$
3. 逆の問いを立てるために反応速度式を反転させる。すなわち、V_max の指定した割合を与えるのはどのような基質濃度か。
  
  $v = f V_{m a x} ⟺ [S] = K_{m} \frac{f}{1 - f}$
4. 10% に達するには K_m の 1/9 が必要であり、90% に達するにはその 9 倍が必要である。
  
  $f = 0.1 : [S] = \frac{K _{m}}{9} = 0.556; f = 0.9 : [S] = 9 K_{m} = 45$
5. したがって、曲線の中央 80% は、基質濃度の 81 倍の範囲にわたっている。
  
  $\frac{9 K _{m}}{K _{m} /9} = 81 ⟹ an 81-fold range for the middle 80%$
解答

ツールには V_max = 100.00 および K_m = 5.00 と表示される。実験室で重要となるのは 81 という数値である。飽和状態への接近は極めて緩やかなため、基質をさらに加えても V_max を測定することはできない。99% に達するには 99 K_m が必要であり、完全に達するには無限大が必要となる。これが、V_max が観察によって直接得られることはなく、常にフィッティングによって求められる理由である。また、これがラインウィーバー＝バークプロットが考案され、そして現在では推奨されない理由でもある。逆数を取ると、データが集中してノイズの多い低濃度領域の点群がフィッティングを支配することになる。プロットのタイプを切り替えて、どの点が拡散するか観察してみよう。

$K_{m} is the half-saturation concentration; 10% \to 90% costs 81 \times [S]$
競合阻害剤と、それに打ち勝つ基質 7 ステップ
同じ酵素に、濃度 5 単位、Kᵢ = 3 の競合阻害剤が作用する。何が変化し何が変化しないかを明らかにし、元の反応速度を取り戻すにはどれだけの追加の基質が必要かを求めよ。

この問題をツールで開く
1. 競合阻害剤は空いている活性部位に結合するため、酵素は本来の働きをする代わりに、別の状態をとることになる。その結合の強さを示すのが解離定数であり、Kᵢ が小さいほど強固に結合して離れにくいことを意味する。
  
  $E + I ⇌ E I, K_{i} = \frac{[ E ] [ I ]}{[ E I ]} = 3$
2. 定常状態の導出過程をたどると、変化するのはただ一つだけである。遊離酵素は機能する状態と阻害された状態に分かれ、その分割比率はどの基質濃度でも変わらない単一の数値となる。
  
  $α = 1 + \frac{[ I ]}{K _{i}} = 1 + \frac{5}{3} = \frac{8}{3} = 2.667$
3. その係数が影響を及ぼすのは Kₘ だけであり、他には一切及ばない。ツールは、元の 5.00 に対して見かけの Kₘ が 13.33 になったこと、そして見かけの Vₘₐₓ は 100.00 のまま変わらないことを示している。
  
  $v = \frac{V _{m a x} [ S ]}{α K _{m} + [ S ]} ⟹ K_{m}^{app} = α K_{m} = 2.667 \times 5 = 13.33, V_{m a x}^{app} = 100.00$
4. Vₘₐₓ が維持されるのは、基質と阻害剤が同じ部位を奪い合っており、基質は純粋に数の力で常に勝つことができるからである。基質が十分に存在すれば、阻害剤が先に結合することは決してない。
5. 基質濃度を固定した場合、その影響は現実のものとなる。以前は半分の速度で反応が進んでいた条件で、現在は 27.27 でしか進まない。つまり阻害剤は、酵素の上限（最大速度）には一切触れることなく、その出力を半分近く奪い去ったのである。
  
  $[S] = 5 : v = \frac{100 \times 5}{13.33 + 5} = 27.27 against \frac{100 \times 5}{5 + 5} = 50.00$
6. では、元の反応速度を取り戻すには基質がどれだけ余分に必要だろうか。阻害時の速度を元の速度と等しいと置いて解けばよい。必要とされる基質量は、見かけの Kₘ が増加したのとまったく同じ係数だけ増加する。これこそが計算全体の中で最も有用な結論である。基質をどれだけ増やさねばならないかを測定すれば、阻害剤の強さを測定したことになるのだ。
  
  $\frac{V _{m a x} [ S ]}{α K _{m} + [ S ]} = \frac{V _{m a x}}{2} ⟹ [S] = α K_{m} = 13.33 = α \times 5$
7. こうして、2 種類の阻害形式は単なる机上の主張ではなく、グラフ上で見分けることができる。同じ 5 単位、同じ Kᵢ = 3 のままツールを非競合阻害のプリセットに切り替えると、数値の立場が入れ替わる。Vₘₐₓ は 37.50 に低下し、Kₘ は 5.00 のまま維持される。この阻害剤は活性部位以外の場所に結合するため、基質をどれほど増やしても太刀打ちできない。
  
  $non-competitive: V_{m a x}^{app} = \frac{V _{m a x}}{α} = \frac{100}{2.667} = 37.50, K_{m}^{app} = 5.00$
解答

Kₘは5.00から13.33へ上昇します。しかしVₘₐₓは変化しません。そして2.667×の基質によって、元の反応速度を取り戻せます。ひとつの係数 α = 1 + [I]/Kᵢ が、これらふたつの役割を果たしています。見かけのKₘに対する乗数であると同時に、速度の回復に必要な基質の増加率でもあるのです。これは今回に限った話ではありません。どのような初期濃度から始めても成り立ちます。阻害剤の代償として求められるのは基質です。決して反応の上限ではありません。

$K_{m}^{app} = α K_{m} = 13.33, V_{m a x} unmoved; [S] \to α [S] restores the rate$

参考文献 (2)

The 1913 paper, in translation, with the original constant: K. A. Johnson and R. S. Goody, "The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis–Menten Paper." Biochemistry 50(39), 8264–8269, 2011.
Steady-state kinetics, and why V_max is fitted rather than measured: A. Cornish-Bowden, Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed., ch. 2–3. Wiley-Blackwell, 2012. ISBN 978-3-527-33074-4.

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