Simulador de amplificação por PCR

Observe as cópias de DNA crescerem exponencialmente ao longo dos ciclos de PCR. Encontre o ciclo limiar Ct.

Exemplo resolvido — Simulador de amplificação por PCR

Cópias finais	1.07 × 10⁹
Fator de amplificação	1.07 × 10⁹×
Ct	27
Fórmula	1 × (1+1)n

Estes são os valores que a calculadora mostra ao abrir a página. Altere qualquer entrada acima para os recalcular.

A carregar a simulação interativa...

C_t transforma multiplicação em subtração 🖖

O eixo vertical do gráfico é logarítmico, então a exponencial pura desta ferramenta desenha uma linha reta — e é isso que dá valor à leitura de C_t. C_t é o ciclo em que a curva cruza o seu limiar, de modo que multiplicar o material inicial desloca a linha inteira lateralmente, sem alterar sua inclinação. Cada mudança de dez vezes em C₀ move C_t em ln 10 / ln(1+e) ciclos: 3,32 com eficiência perfeita, 3,59 com e = 0,9. Carregue o exemplo clínico e leve C₀ de 10 para 100 e para 1000 — C_t cai para 18, 15, 11. Ler a concentração de volta a partir desse deslocamento é toda a base da PCR quantitativa.

Não é exatamente duplicar a cada ciclo 🖖

A PCR funciona como uma fotocopiadora molecular: cada ciclo tenta duplicar cada fita de DNA no tubo. Mas nenhuma enzima copia todos os moldes com perfeição, então a eficiência e define o multiplicador real por ciclo (1 + e) — 2.0 quando perfeita, talvez 1.9 a 90%. Reduza a eficiência na ferramenta e veja esse pequeno déficit por rodada crescer como bola de neve: em 30 ciclos, a diferença entre 1.9× e 2.0× vira milhões de cópias perdidas.

Por que a PCR precisou de um micróbio de Yellowstone 🖖

Cada ciclo aquece o tubo a cerca de 95°C para separar as duas fitas de DNA — quente o bastante para destruir uma polimerase comum. A PCR inicial era penosa: técnicos pipetavam enzima fresca à mão após cada ciclo. O resgate veio de Thermus aquaticus, uma bactéria que prospera nas fontes quase ferventes de Yellowstone, cuja polimerase Taq ignora o calor — deixando toda a reação correr sem intervenção numa única máquina.

Problema resolvido na íntegra

Trinta ciclos de PCR com eficiência perfeita a transformar uma molécula em mil milhões 5 passos
Trinta ciclos de PCR com eficiência perfeita transformam uma molécula num milhar de milhão. Demonstre esse resultado e, em seguida, determine o custo de uma queda de 5% na eficiência — a resposta não é 5%.
1. Cada ciclo copia todas as cadeias presentes, pelo que a população se multiplica por 1 + e. Eficiência perfeita significa e = 1 e uma duplicação direta.
  
  $C_{n} = C_{0} (1 + e)^{n} = 1 \times 2^{30} = 1.07 \times 1 0^{9}$
2. Trinta duplicações correspondem a 2³⁰, cerca de 1,07 milhar de milhão, a partir de uma única molécula inicial. Esta é a razão fundamental pela qual a PCR funciona: uma quantidade demasiado pequena para ser detetada torna-se demasiado grande para passar despercebida, numa única tarde.
3. O ciclo de limiar inverte essa mesma relação — o ciclo no qual a contagem cruza pela primeira vez um limiar de deteção. É um logaritmo, razão pela qual os valores de C_t são comparados por subtração e por que razão um ciclo representa um fator de dois.
  
  $C_{0} (1 + e)^{C_{t}} = 1 0^{8} ⟹ C_{t} = lo g_{2} 1 0^{8} = 26.58 \to 27$
4. Reduza agora a eficiência para 0,95, para que cada ciclo multiplique por 1,95 em vez de 2. Após trinta ciclos, o resultado é 5,02 × 10⁸.
  
  $e = 0.95 : 1.9 5^{30} = 5.02 \times 1 0^{8}$
5. A razão é (2/1,95)³⁰ — um défice por ciclo de 2,5%, capitalizado trinta vezes.
  
  $\frac{2 ^{30}}{1.9 5 ^{30}} = (\frac{2}{1.95})^{30} = 2.14$
Resposta

A ferramenta apresenta 1,07 × 10⁹ cópias e C_t = 27. Uma perda de eficiência de 5% custa um fator de 2,14, mais de metade do rendimento, porque a perda é multiplicada trinta vezes e não somada uma única vez. Essa é a dificuldade central da PCR quantitativa: a leitura é exponencial numa quantidade — a eficiência — que varia entre reações com o design dos iniciadores, a pureza do molde e a própria uniformidade térmica do equipamento. É por isso que a qPCR é sempre realizada em relação a uma curva de calibração em vez de ser aceite como uma contagem absoluta, e por que razão um único inibidor na amostra pode parecer exatamente menos material de partida.

$C_{n} = C_{0} (1 + e)^{n} : e = 1 \Rightarrow 1.07 \times 1 0^{9}, e = 0.95 \Rightarrow 2.14 \times fewer$

Referências (3)

Cₜ, amplification efficiency and how the two are reported: S. A. Bustin et al., "The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments." Clinical Chemistry 55(4), 611–622, 2009.
The real-time kinetic measurement the Cₜ readout models: R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger and R. Watson, "Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions." Nature Biotechnology 11(9), 1026–1030, 1993.
The thermostable polymerase named in the third block: R. K. Saiki et al., "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 239(4839), 487–491, 1988.

Pela equipa 42Math · Verificado com fontes publicadas. Correções bem-vindas.

Simulador de amplificação por PCR

Ct transforma multiplicação em subtração 🖖

Não é exatamente duplicar a cada ciclo 🖖

Por que a PCR precisou de um micróbio de Yellowstone 🖖

C_t transforma multiplicação em subtração 🖖