Das Lambert-Beersche Gesetz

Gib einen molaren Extinktionskoeffizienten, eine Konzentration und eine Küvette vor. Das erste Bild folgt dem Lichtstrahl durch die Zelle. Das zweite zeigt dir, wie verlässlich dein Messwert ist.

Rechenbeispiel — Das Lambert-Beersche Gesetz

Extinktion A	0,6220
Licht durch die Probe	23,88%
Licht, das die Probe blockiert	76,12%
Was das Gerät anzeigt	0,6206
Unsicherheit der Konzentration	1,46%
Der Bestwert dieses Geräts	1,36%
Genauigkeitsverlust gegenüber dem Optimum	1,08×
Verdünnung bis zum Optimum	1,43×

Das sind die Werte, die der Rechner beim Öffnen der Seite anzeigt. Ändere oben eine Eingabe, um sie neu zu berechnen.

Interaktive Simulation wird geladen...

Die erste Einheit an Extinktion kostet 90 % des Lichts. Die zweite kostet 9 %. 🖖

Gib 160,77 als Konzentration ein, bei einem ε von 6.220 und einer 1-cm-Küvette. Die Extinktion liegt bei 1,0000 und 10,00 % des Strahls kommen hindurch. Gib 321,54 ein und sie liegt bei 2,0000, bei 1,00 % Transmission. Tippe 482,32 für 3,0000 und 0,10 %.

Jeder dieser Schritte erhöht die Zahl auf dem Display um denselben Wert. Der erste Schritt hat 90,00 % des einfallenden Strahls geschluckt. Der zweite kostete weitere 9,00 %. Der dritte nahm 0,90 %. Die Zeile Licht, das die Probe blockiert zeigt die laufende Summe: 90,00 %, dann 99,00 %, schließlich 99,90 %.

Schau dir an, wo die gestrichelten Linien in der Küvette liegen. Sie markieren die Tiefe, ab der sich jeweils eine volle Einheit Extinktion angesammelt hat. Ihre Abstände sind exakt gleich. Die Exponentialfunktion fällt schließlich überall in der Zelle mit der gleichen Rate ab. Das Licht hingegen ist nicht gleichmäßig verteilt. Bei A = 3 bekommt der Detektor nur noch ein Tausendstel der ursprünglichen Menge und soll das präzise messen.

Den präzisesten Messwert erhältst du bei A = 0,4343, und es ist nicht der hellste 🖖

Ein Spektralfotometer misst die Transmission. Seine fotometrische Unsicherheit (Anzeigeauflösung, Detektorrauschen, Lampendrift) entspricht grob einer festen Anzahl an Transmissionseinheiten, nicht einem festen Bruchteil der Extinktion. Setzt du das in A = −log₁₀T ein, ergibt sich die relative Unsicherheit der Konzentration als σ_T ÷ (T ln(1/T)).

Weder ε noch ℓ überleben die Division. Zwölf verschiedene Kombinationen aus Extinktionskoeffizient, Konzentration und Schichtdicke, die bei A = 0,4343 landen, liefern auf einem bis auf 0,5 %T genauen Gerät alle denselben Wert von 1,36 %. Die Unsicherheit hängt allein vom Messwert ab. Sie hat nichts mit den restlichen Eigenschaften der Probe zu tun.

Dieser Ausdruck hat ein Maximum im Nenner. T ln(1/T) wird bei T = 1/e am größten. Der beste Messwert liegt also bei A = log₁₀e = 0,4343. Dabei dringen 36,79 % des Lichts durch die Probe. Die Unsicherheit an diesem Punkt beträgt e·σ_T.

Der grüne Bereich auf dem Fehler-Panel markiert die Zone, in der ein Messwert höchstens das Doppelte dieses Bestwerts kostet: A von 0,1007 bis 1,1632. Die Kurve steigt auf beiden Seiten des Minimums an, flach nach unten und steil nach oben. Bei A = 1 liegt der Faktor bei 1,60×, bei A = 2 bei 7,99× und bei A = 3 bei 53,26×. Eine sehr blasse Lösung bietet auch keine Rettung: Schon bei A = 0,1 liegt er bei 2,01×.

Streulicht limitiert die Extinktion auf 3,0004, und keine Chemie hebt diese Grenze auf 🖖

Ein Teil des Lichts erreicht den Detektor, ohne jemals durch die Probe zu gehen. Es streut am Gitter, schlüpft an einem Spiegel vorbei oder reflektiert kreuz und quer im Monochromator. Nennen wir diesen Anteil s. Das Gerät meldet dann −log₁₀[(10^−A + s) ÷ (1 + s)]. Wenn die Probe dunkler wird, hört dieser Ausdruck irgendwann auf zu wachsen. Er nähert sich log₁₀((1 + s)/s) an und bleibt dort stehen.

Klick auf Über der Grenze. Eine millimolare NADH-Lösung hat eine echte Extinktion von 6,2200, doch das Gerät zeigt 3,0002 an. Mehr als die Hälfte der Extinktion fehlt. Diese Seite zeigt dir beide Zahlen, weil sie berechnet wurden. Ein Spektralfotometer hat nur den zweiten Wert und gibt ihn kommentarlos aus.

Die Kurzformel in den meisten Lehrbüchern lautet A_max = −log₁₀ s. Das setzt die Obergrenze auf 3,0000. Die zusätzlichen 0,0004 entstehen, weil der Referenzstrahl dasselbe Streulicht abbekommt.

Die Probleme beginnen schon weit unterhalb dieser Grenze. Bei 0,1 % Streulicht fehlt der angezeigten Extinktion bereits bei A = 1,5811 genau 1 % und bei A = 2,5310 schon 5 %. Dieser Bereich liegt noch dort, wo eine Kalibriergerade absolut überzeugend linear aussieht. Zieh den Schieberegler für das Streulicht und beobachte die rote Linie. Bei 1 % sinkt die Obergrenze auf 2,0043 ab. Bei 0,01 % steigt sie auf 4,0000.

Aufgabe vollständig gelöst

Ein Messwert von 2,49 und eine Konzentration auf ±107 genau 9 Schritte
Ein Enzymassay wird bei 340 nm in einer 1-cm-Küvette gemessen. Das Display zeigt 2,49, und der Analytiker notiert 400 µmol/L NADH. Die Rechnung stimmt. Finde heraus, was diese Zahl wert ist, was stattdessen hätte getan werden sollen und was das Gerät tatsächlich anzeigte.

Öffne diese Aufgabe im Tool
1. NADH absorbiert bei 340 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 6.220 L mol⁻¹ cm⁻¹. Die Konzentration liegt bei 400 µmol/L, also 4,0000 × 10⁻⁴ mol/L. Die Küvette ist 1 cm breit. Das ist schon das ganze Gesetz. Das Tool gibt das Produkt unter Extinktion A aus.
  
  $A = ε c ℓ = 6220 L mo l^{- 1} c m^{- 1} \cdot 4.0000 \times 1 0^{- 4} mol L^{- 1} \cdot 1 cm = 2.4880$
2. Extinktion ist als −log₁₀T definiert, also kehrst du das um. Etwa drei von tausend Photonen verlassen die Küvette. Alles, was der Analytiker gleich behaupten wird, stützt sich darauf, dass das Gerät diese drei von zwei oder vier Photonen unterscheiden kann.
  
  $T = 1 0^{- A} = 1 0^{- 2.4880} = 3.2509 \times 1 0^{- 3} = 0 . 33%$
3. Jetzt packen wir eine Unsicherheit darauf. Das Gerät misst T. Du schreibst also c in Abhängigkeit von T und leitest ab. Das ε und das ℓ tauchen sowohl in der Ableitung als auch in der Konzentration selbst auf und kürzen sich weg. Die relative Unsicherheit hängt allein vom Messwert ab. Sie hat nichts damit zu tun, was in der Küvette ist oder wie dick sie ist.
  
  $c = \frac{- lo g _{10} T}{ε ℓ} ⟹ \frac{d c}{d T} = \frac{- 1}{ε ℓ T ln 10} ⟹ \frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{ε ℓ T ln 10} \cdot \frac{ε ℓ ln 10}{ln ( 1/ T )} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )}$
4. Ein anständiges Laborgerät ist auf etwa 0,5 % der Transmissionsskala genau. Wir setzen also σ_T = 0,005. Wenn du den Ausdruck mit A statt T umschreibst, kannst du die Zahl verwenden, die der erste Schritt bereits geliefert hat. Das Tool gibt 26,85 % unter Unsicherheit der Konzentration aus: Das Ergebnis lautet 400 µmol/L plus/minus 107.
  
  $\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T} 1 0 ^{A}}{A ln 10} = \frac{0 . 005 \cdot 307 . 61}{5 . 72883} = 0.26845400 \cdot 0.26845 = 107 μ mol L^{- 1}$
5. Wo wäre dieser Wert am kleinsten gewesen? Den Nenner T ln(1/T) wollen wir so groß wie möglich haben. Er hat ein einziges Maximum: Ableiten liefert −ln T − 1, was bei T = 1/e null wird. Der beste erreichbare Messwert ist also A = log₁₀e = 0,4343. Die Unsicherheit liegt dort bei e·σ_T = 1,36 %. Der Messwert des Analytikers kostete das 19,75-Fache davon.
  
  $\frac{d}{d T} (- T ln T) = - ln T - 1 = 0 ⟹ T = \frac{1}{e} = 0.36788, A = lo g_{10} e = 0.4343, e σ_{T} = 0.013591 \frac{0 . 26845}{0 . 013591} = 19.75$
6. Zu blass zu messen kostet bei A = 0,1 den Faktor 2,01×. Zu dunkel zu messen kostet bei A = 3 ganze 53,26×. Diese beiden Messwerte sind ähnlich weit vom Optimum entfernt. Ihre Genauigkeit ist jedoch überhaupt nicht vergleichbar. Genau deshalb ist das Fehler-Panel logarithmisch skaliert. Und genau deshalb lautet der Rat im Labor immer: verdünnen statt aufkonzentrieren.
  
  $A 0.1000 0.2000 0.4343 0.7000 1.0000 1.5000 2.0000 2.4880 3.0000 T 79 . 43% 63 . 10% 36 . 79% 19 . 95% 10 . 00% 3 . 16% 1 . 00% 0 . 33% 0 . 10% σ_{c} / c 2 . 73% 1 . 72% 1 . 36% 1 . 55% 2 . 17% 4 . 58% 10 . 86% 26 . 85% 72 . 38% \times floor 2.01 1.27 1.00 1.14 1.60 3.37 7.99 19.75 53.26$
7. Also verdünnen. 2,4880 ÷ 0,4343 = 5,73. Das bringt die Probe auf 69,82 µmol/L, was der Zahl unter Konzentration am Optimum entspricht. Ein einziger Pipettierschritt, und dasselbe Gerät misst 19,75-mal genauer. Die Verdünnung bringt ihre eigene Unsicherheit mit, die sich quadratisch addiert. Sie müsste allerdings schlechter als 26,8 % sein, um dieses Geschäft zu einem Verlust zu machen.
  
  $\frac{A}{lo g _{10} e} = \frac{2 . 4880}{0 . 4343} = 5.73, c_{opt} = \frac{lo g _{10} e}{ε ℓ} = \frac{0 . 4343}{6220} = 6.982 \times 1 0^{- 5} mol L^{- 1} = 69.82 μ mol L^{- 1} 0.2684 5^{2} - 0.01359 1^{2} = 0.268$
8. Nichts davon stand tatsächlich auf dem Display. Bei 0,1 % Streulicht hat das Gerät 2,3720 angezeigt. Das sind 4,7 % weniger als die Extinktion, die die Chemie erzeugt hat. Egal, was sich in der Küvette befand, das Gerät hätte nie mehr als 3,0004 anzeigen können. Die 2,49 des Analytikers steckten bereits zwei Fehler tief in der Misere, noch bevor die Unsicherheit überhaupt mitgezählt wurde.
  
  $A_{meas} = - lo g_{10} \frac{1 0 ^{- A} + s}{1 + s} = - lo g_{10} \frac{3 . 2509 \times 1 0 ^{- 3} + 0 . 001}{1 . 001} = 2.3720, 1 - \frac{2 . 3720}{2 . 4880} = 4 . 7%, A_{m a x} = lo g_{10} \frac{1 . 001}{0 . 001} = 3.0004$
9. Ein Monochromator liefert keine perfekte einzelne Wellenlänge. Nimm an, die Hälfte des Strahls liegt dort, wo ε um 20 % kleiner ist. Genau das passiert bei einer endlichen Spaltbreite an der Flanke eines Absorptionspeaks. Der Detektor addiert die beiden Intensitäten und der Logarithmus wird erst danach gezogen. Die scheinbare Extinktion fällt also unter den intensitätsgewichteten Durchschnitt der beiden. Bei einem nominellen A von 1 zeigt das Gerät 0,8886 an, verglichen mit einem Durchschnitt von 0,9000. Bei nominell 2 liest es 1,7555 statt 1,8000. Das Defizit wächst mit der Konzentration. Die Kalibriergerade biegt sich also zur Konzentrationsachse, anstatt sich parallel zu verschieben. Verankerst du eine Einpunktkalibrierung am Optimum und nutzt sie bei A = 3, fällt die Konzentration um 3,03 % zu niedrig aus. Nichts davon taucht auf dem Panel oben auf. Ein zweites ε und eine Strahlteilung sind drei Regler mehr, als diese Seite besitzt.
  
  $A_{app} = - lo g_{10} [\frac{1}{2} 1 0^{- A} + \frac{1}{2} 1 0^{- 0.8 A}] : A = 1 \to 0.8886 (mean 0.9000), A = 2 \to 1.7555 (mean 1.8000)$
Antwort

400 µmol/L plus/minus 107. Die Rechnung war richtig, der Messwert lag einfach im falschen Bereich. 0,33 % des Strahls kamen durch die Zelle. Die Konzentration trägt 26,85 % Unsicherheit. Das ist das 19,75-Fache der Unsicherheit, die das gleiche Gerät bei A = 0,4343 geliefert hätte.

Verdünnst du 5,73× auf 69,82 µmol/L, erhältst du 69,82 ± 0,95. Zurückgerechnet ergibt das 400 ± 5,4. Gleiche Probe, gleiches Gerät, gleicher Nachmittag.

Und die 2,4880 standen nie auf dem Display. Streulicht hatte bereits 4,7 % davon geschluckt, bevor der Analytiker überhaupt etwas ablas.

$\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )} minimised at T = \frac{1}{e} ⟹ A = lo g_{10} e = 0.4343$

Quellen (5)

The concentration half of the law, and the paper the name comes from: August Beer, "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten", Annalen der Physik 162(5), 78–88, 1852. doi:10.1002/andp.18521620505
Who actually wrote what, which the usual attribution gets wrong: Heinz G. Pfeiffer and Herman A. Liebhafsky, "The origins of Beer's law", Journal of Chemical Education 28(3), 123, 1951. doi:10.1021/ed028p123
The photometric error curve that carries their names: F. Twyman and G. F. Lothian, "Conditions for securing accuracy in spectrophotometry", Proceedings of the Physical Society 45(5), 643–662, 1933. doi:10.1088/0959-5309/45/5/304
An openly readable derivation of the same result, in the same notation: "13.3: Effect of Noise on Transmittance and Absorbance Measurements", Instrumental Analysis, Chemistry LibreTexts (CC BY-NC-SA 4.0).
Where the 6,220 L mol⁻¹ cm⁻¹ for NADH at 340 nm comes from: B. L. Horecker and Arthur Kornberg, "The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides", Journal of Biological Chemistry 175(1), 385–390, 1948. doi:10.1016/S0021-9258(18)57268-9

Vom 42Math-Team · Anhand veröffentlichter Quellen geprüft. Korrekturen willkommen.