La loi de Beer-Lambert

Un dosage enzymatique est lu à 340 nm dans une cuve de 1 cm. L'écran affiche 2,49 et l'analyste note 400 µmol/L de NADH. L'arithmétique est correcte. Évaluez la qualité de cette mesure, trouvez la procédure appropriée et déterminez ce que l'appareil affichait réellement.

Ouvrez ce problème dans l'outil

1. Le NADH absorbe à 340 nm avec une absorptivité molaire de 6 220 L mol⁻¹ cm⁻¹. La concentration est de 400 µmol/L, soit 4,0000 × 10⁻⁴ mol/L, et la cuve mesure 1 cm de large. C'est toute l'étendue de la loi, et l'outil affiche le produit sous Absorbance A.

   $$A=\epsilon c\ell =6220\mathrm{L}\mathrm{mo}{\mathrm{l}}^{-1}\mathrm{c}{\mathrm{m}}^{-1}\cdot 4.0000\times 10^{-4}\mathrm{mol}{\mathrm{L}}^{-1}\cdot 1\mathrm{cm}=2.4880$$

2. L'absorbance se définit par −log₁₀T. En inversant la formule, on constate qu'environ trois photons sur mille sortent de la cuve. Tout ce que l'analyste s'apprête à affirmer repose sur la capacité de l'instrument à distinguer cette quantité de deux ou quatre photons sur mille.

   $$T=10^{-A}=10^{-2.4880}=3.2509\times 10^{-3}=0.33\%$$

3. L'instrument mesure T. Écrivez c en fonction de T et dérivez la fonction. Les termes ε et ℓ apparaissent à la fois dans la dérivée et dans la concentration, ce qui les annule. L'incertitude relative ne dépend donc que de la lecture.

   $$c=\frac{-{\log }_{10}T}{\epsilon \ell }⟹\frac{dc}{dT}=\frac{-1}{\epsilon \ell T\ln 10}⟹\frac{{\sigma }_c}{c}=\frac{{\sigma }_T}{\epsilon \ell T\ln 10}\cdot \frac{\epsilon \ell \ln 10}{\ln (1/T)}=\frac{{\sigma }_T}{T\ln (1/T)}$$

4. Un bon instrument de paillasse est précis à environ 0,5 % de l'échelle de transmittance, donnant σ_T = 0,005. Réécrire l'expression en termes de A plutôt que de T permet d'utiliser le nombre déjà produit à la première étape. L'outil affiche 26,85 % sous Incertitude sur la concentration : la réponse est de 400 µmol/L à 107 près.

   $$\frac{{\sigma }_c}{c}=\frac{{\sigma }_{T}10^A}{A\ln 10}=\frac{0.005\cdot 307.61}{5.72883}=0.26845400\cdot 0.26845=107\mu \mathrm{mol}{\mathrm{L}}^{-1}$$

5. Le dénominateur T ln(1/T) doit être le plus grand possible. Il possède un seul maximum. Sa dérivation donne −ln T − 1, qui vaut zéro à T = 1/e. La meilleure lecture disponible se situe donc à A = log₁₀e = 0,4343. L'incertitude y vaut e·σ_T = 1,36 %. La mesure de l'analyste a coûté 19,75 fois cette valeur.

   $$\frac{d}{dT}(-T\ln T)=-\ln T-1=0⟹T=\frac{1}{e}=0.36788,A={\log }_{10}e=0.4343,e{\sigma }_T=0.013591\frac{0.26845}{0.013591}=19.75$$

6. Lire trop pâle coûte 2,01× à A = 0,1. Lire trop foncé coûte 53,26× à A = 3. Bien que ces deux lectures se trouvent à une distance comparable de l'optimum, leur perte en exactitude n'a plus rien en commun. C'est la raison pour laquelle le panneau des erreurs utilise un axe logarithmique. Cela explique aussi pourquoi les laboratoires conseillent de diluer plutôt que de concentrer.

   $$\begin{array}{rrrr}A& T& {\sigma }_c/c& \times \text{floor}\\ & & & \\ 0.1000& 79.43\%& 2.73\%& 2.01\\ & & & \\ 0.2000& 63.10\%& 1.72\%& 1.27\\ & & & \\ 0.4343& 36.79\%& 1.36\%& 1.00\\ & & & \\ 0.7000& 19.95\%& 1.55\%& 1.14\\ & & & \\ 1.0000& 10.00\%& 2.17\%& 1.60\\ & & & \\ 1.5000& 3.16\%& 4.58\%& 3.37\\ & & & \\ 2.0000& 1.00\%& 10.86\%& 7.99\\ & & & \\ 2.4880& 0.33\%& 26.85\%& 19.75\\ & & & \\ 3.0000& 0.10\%& 72.38\%& 53.26\end{array}$$

7. Il faut donc diluer. L'opération 2,4880 ÷ 0,4343 = 5,73 amène l'échantillon à 69,82 µmol/L, soit le chiffre figurant sous Concentration à l'optimum. Une seule étape de pipetage permet au même instrument de répondre 19,75 fois plus précisément. La dilution comporte sa propre incertitude qui s'ajoute en quadrature. Elle devrait excéder 26,8 % pour rendre ce compromis désavantageux.

   $$\frac{A}{{\log }_{10}e}=\frac{2.4880}{0.4343}=5.73,c_{\text{opt}}=\frac{{\log }_{10}e}{\epsilon \ell }=\frac{0.4343}{6220}=6.982\times 10^{-5}\mathrm{mol}{\mathrm{L}}^{-1}=69.82\mu \mathrm{mol}{\mathrm{L}}^{-1}\sqrt{0.26845^2-0.013591^2}=0.268$$

8. L'écran n'a d'ailleurs rien affiché de tout cela. Avec 0,1 % de lumière parasite, l'instrument rapportait 2,3720. C'est 4,7 % de moins que l'absorbance produite par la chimie. Il n'aurait de toute façon pas pu afficher plus de 3,0004 quel que soit le contenu de la cuve. La valeur de 2,49 notée par l'analyste cumulait déjà deux erreurs avant même l'intégration de l'incertitude.

   $$A_{\text{meas}}=-{\log }_{10}\frac{10^{-A}+s}{1+s}=-{\log }_{10}\frac{3.2509\times 10^{-3}+0.001}{1.001}=2.3720,1-\frac{2.3720}{2.4880}=4.7\%,A_{\max }={\log }_{10}\frac{1.001}{0.001}=3.0004$$

9. Un monochromateur ne délivre jamais une seule longueur d'onde. Supposons que la moitié du faisceau se situe là où ε est 20 % plus faible, ce qu'une largeur de fente finie provoque généralement sur le flanc d'un pic d'absorption. Le détecteur additionne les deux intensités puis calcule le logarithme. L'absorbance apparente tombe ainsi sous la moyenne des deux pondérée par l'intensité. Pour un A nominal de 1, l'instrument indique 0,8886 contre une moyenne de 0,9000. Pour un nominal de 2, il affiche 1,7555 contre 1,8000. Ce déficit augmente avec la concentration, courbant la ligne d'étalonnage vers l'axe de la concentration au lieu de simplement la décaler. Si vous ancrez un étalonnage à un point sur l'optimum et que vous l'utilisez à A = 3, la concentration ressortira à 3,03 % de moins. Le panneau ci-dessus omet ces phénomènes. L'ajout d'un deuxième ε et d'un dédoublement de faisceau nécessiterait trois paramètres supplémentaires par rapport à ce que propose cette page.

   $$A_{\text{app}}=-{\log }_{10}[\frac{1}{2}10^{-A}+\frac{1}{2}10^{-0.8A}]:A=1\to 0.8886(\text{mean }0.9000),A=2\to 1.7555(\text{mean }1.8000)$$