La ley de Beer-Lambert

Ajusta una absortividad molar, una concentración y una cubeta. La primera imagen sigue al haz a través de la celda; la segunda te dice lo que vale la lectura que has obtenido.

Ejemplo resuelto — La ley de Beer-Lambert

Absorbancia A	0,6220
Luz que atraviesa la muestra	23,88%
Luz que detiene la muestra	76,12%
Lo que indica el instrumento	0,6206
Incertidumbre en la concentración	1,46%
Lo mejor que puede hacer este instrumento	1,36%
Coste de esta lectura frente a la mejor	1,08×
Dilución que alcanza el óptimo	1,43×

Estos son los valores que muestra la calculadora al abrir la página. Cambia cualquier entrada de arriba para recalcularlos.

Cargando simulación interactiva...

La primera unidad de absorbancia cuesta el 90% de la luz. La segunda cuesta un 9%. 🖖

Escribe 160,77 en la concentración, con ε en 6.220 y una celda de 1 cm. La absorbancia indica 1,0000 y el 10,00% del haz la atraviesa. Escribe 321,54 y leerá 2,0000, con el 1,00% atravesando. Escribe 482,32 para 3,0000 y el 0,10%.

Cada uno de esos pasos suma la misma cantidad al número de la pantalla. El primero se llevó el 90,00% del haz incidente; el segundo se llevó un 9,00% adicional; el tercero se llevó un 0,90%. La fila Luz que detiene la muestra imprime el total acumulado: 90,00%, luego 99,00%, luego 99,90%.

Fíjate dónde caen las líneas discontinuas en la cubeta. Marcan la profundidad a la que se ha acumulado cada unidad entera de absorbancia, y están espaciadas uniformemente porque la exponencial decae al mismo ritmo en toda la celda. Lo que no está espaciado uniformemente es la luz. Para cuando llegamos a A = 3, al detector se le está entregando una milésima parte de lo que entró y se le pide que lo mida bien.

La lectura más precisa disponible es A = 0,4343, y no es la más pálida 🖖

Un espectrofotómetro mide la transmitancia. Su incertidumbre fotométrica (resolución de lectura, ruido del detector, deriva de la lámpara) es a grandes rasgos un número fijo de unidades de transmitancia y no una fracción fija de la absorbancia. Pasa eso por A = −log₁₀T y la incertidumbre relativa en la concentración sale como σ_T ÷ (T ln(1/T)).

Ni ε ni ℓ sobreviven a la división. Doce combinaciones diferentes de absortividad, concentración y paso óptico que aterrizan en A = 0,4343 dan todas el mismo 1,36% en un instrumento con precisión de 0,5 %T. La incertidumbre depende de la lectura y de absolutamente nada más acerca de la muestra.

Esa expresión tiene un máximo en su denominador. T ln(1/T) alcanza su valor máximo en T = 1/e, por lo que la mejor lectura se sitúa en A = log₁₀e = 0,4343, con un 36,79% de la luz atravesando, y la incertidumbre allí es e·σ_T.

La franja verde en el panel de error marca dónde una lectura no cuesta más del doble de ese mínimo: desde una A de 0,1007 hasta 1,1632. La curva asciende a ambos lados del mínimo, suavemente por debajo y de forma pronunciada por encima. En A = 1 la penalización es de 1,60×, en A = 2 es de 7,99×, en A = 3 es de 53,26×. Y una solución pálida no sirve de refugio: en A = 0,1 la penalización ya es de 2,01×.

La luz parásita pone un techo a la absorbancia en 3,0004, y ninguna química lo levanta 🖖

Parte de la fuente llega al detector sin pasar por la muestra. Se dispersa en la red de difracción, se filtra por un espejo o rebota dentro del monocromador. Llamaremos s a esa fracción. Lo que el instrumento indica es entonces −log₁₀[(10^−A + s) ÷ (1 + s)], y a medida que la muestra se oscurece esa expresión deja de subir: se acerca a log₁₀((1 + s)/s) y no avanza más.

Pulsa Más allá del techo. Una solución milimolar de NADH tiene una verdadera absorbancia de 6,2200 y el instrumento indica 3,0002. Falta más de la mitad de la absorbancia. Esta página te muestra ambos números porque los ha calculado; un espectrofotómetro solo tiene el segundo y lo imprime sin ninguna advertencia.

La fórmula abreviada que dan la mayoría de los libros es A_max = −log₁₀ s, lo que sitúa el techo en 3,0000. El 0,0004 adicional ocurre porque el haz de referencia detecta esa misma fuga.

Los problemas empiezan muy por debajo del techo. Con un 0,1% de luz parásita, la absorbancia indicada se queda un 1% corta en A = 1,5811 y un 5% corta en A = 2,5310, lo que cae dentro del rango en el que una curva de calibración todavía parece convincentemente recta. Arrastra el control deslizante de luz parásita y observa cómo se mueve la línea roja: al 1% el techo cae a 2,0043, y al 0,01% sube a 4,0000.

Problema resuelto al detalle

Una lectura de 2,49, y una concentración que vale ±107 9 pasos
Un ensayo enzimático se lee a 340 nm en una cubeta de 1 cm. La pantalla muestra 2,49 y el analista anota 400 µmol/L de NADH. La aritmética es correcta. Calcula lo que vale ese número, lo que se debería haber hecho en su lugar y lo que el instrumento estaba indicando realmente.

Abre este problema en la herramienta
1. El NADH absorbe a 340 nm con una absortividad molar de 6.220 L mol⁻¹ cm⁻¹. La concentración es de 400 µmol/L, que equivale a 4,0000 × 10⁻⁴ mol/L, y la celda mide 1 cm de ancho. Esa es toda la ley, y la herramienta imprime el producto en Absorbancia A.
  
  $A = ε c ℓ = 6220 L mo l^{- 1} c m^{- 1} \cdot 4.0000 \times 1 0^{- 4} mol L^{- 1} \cdot 1 cm = 2.4880$
2. La absorbancia se define como −log₁₀T, así que inviértela. Aproximadamente tres fotones de cada mil logran salir de la cubeta. Todo lo que el analista está a punto de afirmar se basa en que el instrumento sepa distinguir eso de dos de cada mil, o de cuatro.
  
  $T = 1 0^{- A} = 1 0^{- 2.4880} = 3.2509 \times 1 0^{- 3} = 0 . 33%$
3. Ahora ponle una incertidumbre. El instrumento mide T, así que escribe c en función de T y deriva. La ε y la ℓ aparecen tanto en la derivada como en la propia concentración, y se anulan: la incertidumbre relativa depende exclusivamente de la lectura, no de lo que hay en la cubeta ni de lo ancha que es.
  
  $c = \frac{- lo g _{10} T}{ε ℓ} ⟹ \frac{d c}{d T} = \frac{- 1}{ε ℓ T ln 10} ⟹ \frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{ε ℓ T ln 10} \cdot \frac{ε ℓ ln 10}{ln ( 1/ T )} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )}$
4. Un buen instrumento de laboratorio tiene una precisión de aproximadamente el 0,5% de la escala de transmitancia, por lo que σ_T = 0,005. Reescribir la expresión en función de A en lugar de T te permite usar el número que ya produjo el primer paso. La herramienta imprime 26,85% en Incertidumbre en la concentración: la respuesta es 400 µmol/L más o menos 107.
  
  $\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T} 1 0 ^{A}}{A ln 10} = \frac{0 . 005 \cdot 307 . 61}{5 . 72883} = 0.26845400 \cdot 0.26845 = 107 μ mol L^{- 1}$
5. ¿Dónde habría sido menor? El denominador T ln(1/T) es lo que queremos maximizar, y tiene un único máximo: al derivar da −ln T − 1, que es cero en T = 1/e. Así que la mejor lectura disponible es A = log₁₀e = 0,4343, y la incertidumbre allí es e·σ_T = 1,36%. La lectura del analista costó 19,75 veces eso.
  
  $\frac{d}{d T} (- T ln T) = - ln T - 1 = 0 ⟹ T = \frac{1}{e} = 0.36788, A = lo g_{10} e = 0.4343, e σ_{T} = 0.013591 \frac{0 . 26845}{0 . 013591} = 19.75$
6. Leer demasiado pálido cuesta 2,01× en A = 0,1. Leer demasiado oscuro cuesta 53,26× en A = 3. Esas dos lecturas están a una distancia comparable del óptimo y ni por asomo a una distancia comparable en exactitud. Esa es la razón por la que el panel de error se dibuja en un eje logarítmico, y por la que el consejo que da un laboratorio es diluir en lugar de concentrar.
  
  $A 0.1000 0.2000 0.4343 0.7000 1.0000 1.5000 2.0000 2.4880 3.0000 T 79 . 43% 63 . 10% 36 . 79% 19 . 95% 10 . 00% 3 . 16% 1 . 00% 0 . 33% 0 . 10% σ_{c} / c 2 . 73% 1 . 72% 1 . 36% 1 . 55% 2 . 17% 4 . 58% 10 . 86% 26 . 85% 72 . 38% \times floor 2.01 1.27 1.00 1.14 1.60 3.37 7.99 19.75 53.26$
7. Por tanto, diluye. 2,4880 ÷ 0,4343 = 5,73, lo que lleva la muestra a 69,82 µmol/L, la cifra que figura bajo Concentración en el óptimo. Un paso de pipeteo, y el mismo instrumento responde con una precisión 19,75 veces mayor. La dilución conlleva una incertidumbre propia que se suma en cuadratura, y tendría que ser peor que el 26,8% para que el intercambio no mereciera la pena.
  
  $\frac{A}{lo g _{10} e} = \frac{2 . 4880}{0 . 4343} = 5.73, c_{opt} = \frac{lo g _{10} e}{ε ℓ} = \frac{0 . 4343}{6220} = 6.982 \times 1 0^{- 5} mol L^{- 1} = 69.82 μ mol L^{- 1} 0.2684 5^{2} - 0.01359 1^{2} = 0.268$
8. Nada de esto es lo que decía la pantalla. Con un 0,1% de luz parásita el instrumento indicó 2,3720, que se queda un 4,7% corto respecto a la absorbancia que produjo la química, y no podría haber indicado por encima de 3,0004 entrara lo que entrara en la cubeta. El 2,49 del analista ya tenía dos errores de profundidad antes de que se contara la incertidumbre.
  
  $A_{meas} = - lo g_{10} \frac{1 0 ^{- A} + s}{1 + s} = - lo g_{10} \frac{3 . 2509 \times 1 0 ^{- 3} + 0 . 001}{1 . 001} = 2.3720, 1 - \frac{2 . 3720}{2 . 4880} = 4 . 7%, A_{m a x} = lo g_{10} \frac{1 . 001}{0 . 001} = 3.0004$
9. Un monocromador no entrega una única longitud de onda. Supón que la mitad del haz se sitúa donde ε es un 20% menor, que es lo que hace un ancho de rendija finito en el flanco de un pico de absorción. El detector suma las dos intensidades y el logaritmo se aplica una sola vez, después, por lo que la absorbancia aparente cae por debajo de la media ponderada por intensidad de ambas. En una A nominal de 1, el instrumento lee 0,8886 frente a una media de 0,9000; en una de 2 nominal, lee 1,7555 frente a 1,8000. El déficit crece con la concentración, por lo que la línea de calibración se curva hacia el eje de la concentración en lugar de desplazarse. Fija una calibración de un solo punto en el óptimo, úsala en A = 3, y la concentración saldrá un 3,03% baja. Nada de eso está en el panel de arriba. Una segunda ε y una división del haz son tres controles más de los que tiene esta página.
  
  $A_{app} = - lo g_{10} [\frac{1}{2} 1 0^{- A} + \frac{1}{2} 1 0^{- 0.8 A}] : A = 1 \to 0.8886 (mean 0.9000), A = 2 \to 1.7555 (mean 1.8000)$
Respuesta

400 µmol/L más o menos 107. La aritmética era correcta y la lectura estaba en el lugar equivocado: un 0,33% del haz a través de la celda, un 26,85% en la concentración, 19,75 veces la incertidumbre que habría dado el mismo instrumento en A = 0,4343.

Diluir 5,73× a 69,82 µmol/L da 69,82 ± 0,95, lo que al multiplicar de vuelta da 400 ± 5,4. Misma muestra, mismo instrumento, misma tarde.

Y el 2,4880 nunca estuvo en la pantalla. La luz parásita se había llevado el 4,7% antes de que el analista leyera nada.

$\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )} minimised at T = \frac{1}{e} ⟹ A = lo g_{10} e = 0.4343$

Referencias (5)

The concentration half of the law, and the paper the name comes from: August Beer, "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten", Annalen der Physik 162(5), 78–88, 1852. doi:10.1002/andp.18521620505
Who actually wrote what, which the usual attribution gets wrong: Heinz G. Pfeiffer and Herman A. Liebhafsky, "The origins of Beer's law", Journal of Chemical Education 28(3), 123, 1951. doi:10.1021/ed028p123
The photometric error curve that carries their names: F. Twyman and G. F. Lothian, "Conditions for securing accuracy in spectrophotometry", Proceedings of the Physical Society 45(5), 643–662, 1933. doi:10.1088/0959-5309/45/5/304
An openly readable derivation of the same result, in the same notation: "13.3: Effect of Noise on Transmittance and Absorbance Measurements", Instrumental Analysis, Chemistry LibreTexts (CC BY-NC-SA 4.0).
Where the 6,220 L mol⁻¹ cm⁻¹ for NADH at 340 nm comes from: B. L. Horecker and Arthur Kornberg, "The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides", Journal of Biological Chemistry 175(1), 385–390, 1948. doi:10.1016/S0021-9258(18)57268-9

Por el equipo de 42Math · Contrastado con fuentes publicadas. Se agradecen correcciones.