A Lei de Beer-Lambert

Defina uma absortividade molar, uma concentração e uma cuvete. O primeiro gráfico acompanha o feixe através da célula e o segundo indica a fiabilidade da leitura obtida.

Exemplo resolvido — A Lei de Beer-Lambert

Absorbância A	0,6220
Luz que atravessa a amostra	23,88%
Luz retida pela amostra	76,12%
O que o instrumento reporta	0,6206
Maior absorbância reportável	3,0004
Incerteza na concentração	1,46%
O melhor que o instrumento faz	1,36%
Custo desta leitura face à melhor	1,08×

Estes são os valores que a calculadora mostra ao abrir a página. Altere qualquer entrada acima para os recalcular.

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A primeira unidade de absorbância custa 90% da luz. A segunda custa 9%. 🖖

Introduza 160,77 na concentração, com ε a 6.220 e uma célula de 1 cm. A absorbância marca 1,0000 e 10,00% do feixe atravessa a amostra. Introduza 321,54 e a leitura passará para 2,0000, com 1,00% de passagem. Um valor de 482,32 conduzirá a 3,0000 e 0,10%.

Cada um desses passos adiciona a mesma quantidade ao número no ecrã. O primeiro consumiu 90,00% do feixe incidente; o segundo levou mais 9,00% e o terceiro absorveu 0,90%. A linha Luz retida pela amostra apresenta o total acumulado correspondente a 90,00%, depois 99,00% e finalmente 99,90%.

Observe o local onde caem as linhas tracejadas na cuvete. Estas marcam a profundidade na qual cada unidade inteira de absorbância se acumulou. As linhas encontram-se uniformemente espaçadas porque a exponencial decai à mesma taxa em toda a célula. A luz é que não está distribuída de forma uniforme. Quando se atinge A = 3, é entregue ao detetor uma milésima parte da intensidade que entrou e pede-se-lhe que a meça bem.

A leitura mais precisa disponível é A = 0,4343, e não é a mais pálida 🖖

Um espectrofotómetro mede a transmitância. A sua incerteza fotométrica (tais como a resolução de leitura, o ruído do detetor ou o desvio da lâmpada) é aproximadamente um número fixo de unidades de transmitância, em vez de uma fração fixa da absorbância. Se aplicar essa premissa a A = −log₁₀T, a incerteza relativa na concentração resultará na expressão σ_T ÷ (T ln(1/T)).

Nem ε nem ℓ sobrevivem à divisão. Doze combinações diferentes de absortividade, concentração e comprimento óptico que calhem em A = 0,4343 produzem exatamente os mesmos 1,36% num instrumento com exatidão de 0,5 %T. A incerteza depende em exclusivo da leitura.

A expressão possui um máximo no seu denominador. T ln(1/T) atinge o valor mais elevado em T = 1/e, de modo que a melhor leitura se situa em A = log₁₀e = 0,4343 com 36,79% da luz a conseguir passar, sendo a incerteza correspondente igual a e·σ_T.

A faixa verde no painel de erro representa a zona onde uma leitura custa no máximo o dobro do limite inferior, cobrindo os valores de A desde 0,1007 até 1,1632. A curva sobe de ambos os lados do mínimo, exibindo um crescimento suave na parte inferior e de forma acentuada acima desta. Em A = 1 a penalização é de 1,60×, subindo para 7,99× em A = 2 e disparando para 53,26× quando A = 3. Recorrer a uma solução pálida também não serve de refúgio, pois a penalização já vai em 2,01× logo em A = 0,1.

A luz parasita impõe um teto à absorbância em 3,0004, e nenhuma química o consegue elevar 🖖

Parte da radiação da fonte atinge o detetor sem passar pela amostra. Esta pode dispersar-se na rede de difração, escapar por um espelho ou refletir-se no interior do monocromador. Chamemos s a essa fração. O que o instrumento reporta é então definido por −log₁₀[(10^−A + s) ÷ (1 + s)]. À medida que a amostra escurece, a expressão para de subir e aproxima-se de log₁₀((1 + s)/s) sem avançar mais.

Prima Para além do limite. Uma solução milimolar de NADH tem uma absorbância verdadeira de 6,2200 e o instrumento reporta 3,0002. Falta mais de metade da absorbância. Esta página mostra os dois números em simultâneo porque os calculou analiticamente, mas um espectrofotómetro possui apenas o segundo valor e imprime-o de forma cega.

O atalho apresentado pela maior parte dos livros define A_max = −log₁₀ s, o qual coloca o teto em 3,0000. Os 0,0004 adicionais devem-se ao facto de o feixe de referência sofrer o mesmo efeito de fuga.

Os problemas começam a notar-se bem abaixo desse teto. Com 0,1% de luz parasita, a absorbância reportada fica 1% aquém em A = 1,5811 e 5% aquém em A = 2,5310, situando-se numa zona onde uma curva de calibração ainda pareceria convincentemente reta. Arraste o cursor de luz parasita e veja a linha vermelha mover-se ao longo do gráfico. Quando s sobe para 1% o teto desce até 2,0043, enquanto que uma redução para 0,01% eleva o limite até aos 4,0000.

Problema resolvido na íntegra

Uma leitura de 2,49 e uma concentração com incerteza de ±107 9 passos
Um ensaio enzimático é lido a 340 nm numa cuvete de 1 cm. O ecrã exibe 2,49 e o analista regista 400 µmol/L de NADH. A aritmética está correta. Descubra a fiabilidade desse número, identifique o que deveria ter sido feito em vez disso e verifique o que o instrumento estava de facto a reportar.

Abrir este problema na ferramenta
1. O NADH absorve radiação a 340 nm com uma absortividade molar de 6.220 L mol⁻¹ cm⁻¹. A concentração de 400 µmol/L corresponde a 4,0000 × 10⁻⁴ mol/L no interior de uma célula com 1 cm de largura. Isto resume a totalidade da lei e a ferramenta imprime o produto final sob Absorbância A.
  
  $A = ε c ℓ = 6220 L mo l^{- 1} c m^{- 1} \cdot 4.0000 \times 1 0^{- 4} mol L^{- 1} \cdot 1 cm = 2.4880$
2. A absorbância define-se como −log₁₀T, pelo que será necessário inverter o seu valor. Verifica-se que cerca de três fotões num milhar saem da cuvete, o que significa que tudo aquilo que o analista se prepara para afirmar baseia-se na capacidade de o instrumento distinguir esse valor face a dois num milhar ou a quatro fotões num milhar.
  
  $T = 1 0^{- A} = 1 0^{- 2.4880} = 3.2509 \times 1 0^{- 3} = 0 . 33%$
3. Iremos agora atribuir-lhe uma incerteza. Como o instrumento mede T, pode-se escrever c em função de T e derivar a expressão. O ε e o ℓ aparecem tanto na derivada como na própria concentração acabando por se anular mutuamente. A incerteza relativa passa a depender exclusivamente da leitura.
  
  $c = \frac{- lo g _{10} T}{ε ℓ} ⟹ \frac{d c}{d T} = \frac{- 1}{ε ℓ T ln 10} ⟹ \frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{ε ℓ T ln 10} \cdot \frac{ε ℓ ln 10}{ln ( 1/ T )} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )}$
4. Um instrumento de bancada decente garante uma precisão a rondar os 0,5% da escala de transmitância, fixando σ_T = 0,005. Ao reescrever a expressão em função de A em vez de T consegue-se utilizar o número que o primeiro passo já produziu. A ferramenta apresenta 26,85% sob Incerteza na concentração, concluindo-se que a resposta será de 400 µmol/L com uma margem de mais ou menos 107.
  
  $\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T} 1 0 ^{A}}{A ln 10} = \frac{0 . 005 \cdot 307 . 61}{5 . 72883} = 0.26845400 \cdot 0.26845 = 107 μ mol L^{- 1}$
5. Onde é que o valor teria sido o mais pequeno? Pretendemos maximizar o denominador T ln(1/T), que possui um único máximo no qual a derivação resulta em −ln T − 1 e anula-se em T = 1/e. A melhor leitura disponível fixa-se em A = log₁₀e = 0,4343 acompanhada de uma incerteza correspondente a e·σ_T = 1,36%. A leitura do analista teve um custo 19,75 vezes superior a esse valor.
  
  $\frac{d}{d T} (- T ln T) = - ln T - 1 = 0 ⟹ T = \frac{1}{e} = 0.36788, A = lo g_{10} e = 0.4343, e σ_{T} = 0.013591 \frac{0 . 26845}{0 . 013591} = 19.75$
6. Uma leitura demasiado pálida custa 2,01× em A = 0,1 enquanto que uma leitura demasiado escura custa 53,26× em A = 3. Estas duas leituras encontram-se a uma distância comparável do ponto ideal, mas apresentam níveis de exatidão completamente díspares. É por esse motivo que o painel de erro está desenhado num eixo logarítmico e que se aconselha normalmente os laboratórios a diluir em vez de concentrarem as amostras.
  
  $A 0.1000 0.2000 0.4343 0.7000 1.0000 1.5000 2.0000 2.4880 3.0000 T 79 . 43% 63 . 10% 36 . 79% 19 . 95% 10 . 00% 3 . 16% 1 . 00% 0 . 33% 0 . 10% σ_{c} / c 2 . 73% 1 . 72% 1 . 36% 1 . 55% 2 . 17% 4 . 58% 10 . 86% 26 . 85% 72 . 38% \times floor 2.01 1.27 1.00 1.14 1.60 3.37 7.99 19.75 53.26$
7. Proceda então à diluição. O cálculo 2,4880 ÷ 0,4343 = 5,73 reduz a amostra para 69,82 µmol/L, sendo este o valor que surge sob Concentração no ponto ideal. Bastou um passo de pipetagem para que o mesmo instrumento respondesse de forma 19,75 vezes mais precisa. A diluição acarreta uma incerteza própria que se adiciona em quadratura, e teria de ser pior do que 26,8% para que não valesse a pena fazer a troca.
  
  $\frac{A}{lo g _{10} e} = \frac{2 . 4880}{0 . 4343} = 5.73, c_{opt} = \frac{lo g _{10} e}{ε ℓ} = \frac{0 . 4343}{6220} = 6.982 \times 1 0^{- 5} mol L^{- 1} = 69.82 μ mol L^{- 1} 0.2684 5^{2} - 0.01359 1^{2} = 0.268$
8. No entanto, nada disto foi aquilo que o ecrã indicou. O instrumento reportou 2,3720 face aos 0,1% de luz parasita, um valor que fica 4,7% aquém da absorbância que a química produziu. O equipamento seria incapaz de reportar acima de 3,0004 independentemente daquilo que entrasse na cuvete. O valor de 2,49 registado pelo analista acumulava dois erros profundos antes mesmo de a incerteza ter sido quantificada.
  
  $A_{meas} = - lo g_{10} \frac{1 0 ^{- A} + s}{1 + s} = - lo g_{10} \frac{3 . 2509 \times 1 0 ^{- 3} + 0 . 001}{1 . 001} = 2.3720, 1 - \frac{2 . 3720}{2 . 4880} = 4 . 7%, A_{m a x} = lo g_{10} \frac{1 . 001}{0 . 001} = 3.0004$
9. O monocromador não fornece um único comprimento de onda e convém supor que metade do feixe incide onde ε é 20% mais baixo, algo típico em fendas de largura finita no flanco de um pico de absorção. O detetor soma as duas intensidades antes de o logaritmo ser calculado uma única vez no final, fazendo com que a absorbância aparente caia abaixo da média ponderada. Num A nominal de 1 o instrumento lê 0,8886 perante uma média de 0,9000; para um valor nominal de 2, a leitura será de 1,7555 perante 1,8000. O défice cresce com a concentração e a linha de calibração passa a curvar-se em direção ao eixo da concentração em vez de se deslocar de forma paralela. Se ancorar uma calibração de ponto único no valor ideal e a utilizar em A = 3, a concentração surgirá 3,03% abaixo da realidade. Estes fenómenos não constam no painel acima, visto que um segundo ε e uma divisão de feixe exigiriam mais três controlos do que os atualmente disponíveis nesta página.
  
  $A_{app} = - lo g_{10} [\frac{1}{2} 1 0^{- A} + \frac{1}{2} 1 0^{- 0.8 A}] : A = 1 \to 0.8886 (mean 0.9000), A = 2 \to 1.7555 (mean 1.8000)$
Resposta

O valor é de 400 µmol/L mais ou menos 107. A aritmética estava certa mas a leitura encontrava-se no lugar errado: 0,33% do feixe passava através da célula e atribuía 26,85% à concentração. A incerteza foi 19,75 vezes superior àquela que o mesmo instrumento teria fornecido em A = 0,4343.

Diluir 5,73× para 69,82 µmol/L fornece 69,82 ± 0,95, que se multiplicará de volta para os 400 ± 5,4. Tudo isto feito com a mesma amostra e o mesmo equipamento.

De salientar ainda que os 2,4880 nunca chegaram a estar no ecrã. A luz parasita tinha consumido 4,7% desse valor antes sequer de o analista ter procedido a qualquer leitura.

$\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )} minimised at T = \frac{1}{e} ⟹ A = lo g_{10} e = 0.4343$

Referências (5)

The concentration half of the law, and the paper the name comes from: August Beer, "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten", Annalen der Physik 162(5), 78–88, 1852. doi:10.1002/andp.18521620505
Who actually wrote what, which the usual attribution gets wrong: Heinz G. Pfeiffer and Herman A. Liebhafsky, "The origins of Beer's law", Journal of Chemical Education 28(3), 123, 1951. doi:10.1021/ed028p123
The photometric error curve that carries their names: F. Twyman and G. F. Lothian, "Conditions for securing accuracy in spectrophotometry", Proceedings of the Physical Society 45(5), 643–662, 1933. doi:10.1088/0959-5309/45/5/304
An openly readable derivation of the same result, in the same notation: "13.3: Effect of Noise on Transmittance and Absorbance Measurements", Instrumental Analysis, Chemistry LibreTexts (CC BY-NC-SA 4.0).
Where the 6,220 L mol⁻¹ cm⁻¹ for NADH at 340 nm comes from: B. L. Horecker and Arthur Kornberg, "The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides", Journal of Biological Chemistry 175(1), 385–390, 1948. doi:10.1016/S0021-9258(18)57268-9

Pela equipa 42Math · Verificado com fontes publicadas. Correções bem-vindas.