Beer-Lamberti seadus

Määra molaarne neelduvustegur, kontsentratsioon ja küvett. Esimene joonis jälgib kiirt läbi raku. Teine näitab, kui väärtuslik on saadud näit.

Näidisarvutus — Beer-Lamberti seadus

Neelduvus A	0,6220
Proovi läbiv valgus	23,88%
Proovi neelatud valgus	76,12%
Seadme teatatud näit	0,6206
Seadme suurim neelduvus	3,0004
Kontsentratsiooni määramatus	1,46%
Parim võimalik tulemus	1,36%
Näidu hind parima suhtes	1,08×

Need on väärtused, mida kalkulaator lehe avamisel näitab. Muuda ülal mõnda sisendit, et need ümber arvutada.

Interaktiivse simulatsiooni laadimine...

Esimene neelduvuse ühik võtab 90% valgusest. Teine võtab 9%. 🖖

Sisesta kontsentratsiooniks 160,77. Hoia ε väärtusel 6220 ja kasuta 1 cm rakku. Neelduvuse näit on 1,0000 ja 10,00% kiirest läheb läbi. Sisesta 321,54 ja näit on 2,0000, millest läheb läbi 1,00%. Sisesta 482,32 ja saad 3,0000 ning 0,10%.

Iga samm lisab ekraanil olevale arvule sama palju. Esimene võttis langevast kiirest 90,00%. Teine võttis täiendavalt 9,00%. Kolmas võttis 0,90%. Rida Proovi neelatud valgus näitab jooksvat summat: 90,00%, siis 99,00%, siis 99,90%.

Vaata, kuhu langevad küvetis katkendjooned. Need tähistavad sügavust, kuhu on kogunenud iga täis neelduvuse ühik. Jooned paiknevad ühtlaste vahedega, sest eksponentsiaalne kahanemine toimub rakus igal pool sama kiirusega. Valgus pole see, mis oleks ühtlaste vahedega jaotunud. Näidu A = 3 juures antakse detektorile tuhandik sisenenud valgusest ja palutakse seda hästi mõõta.

Kõige täpsem kättesaadav näit on A = 0,4343 ja see pole sugugi kõige heledam 🖖

Spektrofotomeeter mõõdab läbilaskvust. Selle fotomeetriline määramatus (näidu lahutusvõime, detektori müra, lambi triiv) on pigem kindel arv läbilaskvuse ühikuid kui kindel murdosa neelduvusest. Arvuta see läbi valemi A = −log₁₀T ja kontsentratsiooni suhteline määramatus on σ_T ÷ (T ln(1/T)).

Ei ε ega ℓ ela seda jagamist üle. Kaksteist erinevat neelduvusteguri, kontsentratsiooni ja kihi paksuse kombinatsiooni, mis annavad tulemuseks A = 0,4343, annavad instrumendil täpsusega 0,5 %T kõik sama tulemuse 1,36%. Määramatus sõltub ainult näidust. See ei sõltu millestki muust proovi juures.

Selle avaldise nimetajas on maksimum. Avaldis T ln(1/T) on suurim kohal T = 1/e. Parim näit asub seega kohal A = log₁₀e = 0,4343. Seal läheb läbi 36,79% valgusest ja määramatus on e·σ_T.

Roheline riba veapaneelil tähistab ala, kus näit ei maksa rohkem kui kaks korda alampiirist. A jääb sinna vahemikus 0,1007 kuni 1,1632. Kõver tõuseb miinimumi mõlemal küljel. Allpool tõuseb see laugelt ja ülalpool järsult. Kohal A = 1 on karistus 1,60×, kohal A = 2 on see 7,99× ning kohal A = 3 on see 53,26×. Hele lahus ei paku samuti varjupaika. Kohal A = 0,1 on karistus juba 2,01×.

Hajuvalgus seab neelduvuse laeks 3,0004 ja ükski keemia seda ei tõsta 🖖

Osa allikast jõuab detektorini proovi läbimata. See hajub võrelt, lekib peegli juurest mööda, põrkab monokromaatori sees ringi. Nimetame seda osa tähega s. Instrument teatab sel juhul näidu −log₁₀[(10^−A + s) ÷ (1 + s)]. Proovi tumenedes lõpetab see avaldis kasvamise. See läheneb väärtusele log₁₀((1 + s)/s) ega lähe sealt edasi.

Vajuta Üle lae. Millimolaarse NADH lahuse tegelik neelduvus on 6,2200, kuid instrument teatab 3,0002. Üle poole neelduvusest on puudu. Lehekülg näitab sulle mõlemat arvu, sest arvutas need ise. Spektrofotomeetril on olemas ainult teine arv ja ta esitab selle ilma ühegi hoiatuseta.

Enamikus raamatutes toodud lühivorm A_max = −log₁₀ s seab laeks 3,0000. See lisanduv 0,0004 tuleneb võrdluskiirest, mis näeb täpselt sama leket.

Probleemid algavad ammu enne lage. Hajuvalguse 0,1% juures jääb teatatud neelduvus tegelikust 1% madalamaks juba kohal A = 1,5811. Kohal A = 2,5310 on see puudu 5%. See vahemik on täpselt seal, kus kalibreerimiskõver tundub veel veenvalt sirge. Lohista hajuvalguse liugurit ja vaata punase joone liikumist: 1% juures langeb lagi väärtuseni 2,0043, 0,01% juures tõuseb aga 4,0000 peale.

Ülesanne täielikult lahendatud

Näit 2,49 ja kontsentratsioon määramatusega ±107 9 sammu
Ensüümi testi loetakse lainepikkusel 340 nm ja 1 cm küvetis. Ekraan näitab 2,49 ning analüütik märgib üles NADH kontsentratsiooni 400 µmol/L. Aritmeetika on õige. Arvuta välja, mida see arv väärt on. Leia ka see, mida oleks tulnud hoopis teha ja mida instrument tegelikult teatas.

Ava see ülesanne tööriistas
1. NADH neelab lainepikkusel 340 nm molaarse neelduvusteguriga 6220 L mol⁻¹ cm⁻¹. Kontsentratsioon on 400 µmol/L, mis teeb 4,0000 × 10⁻⁴ mol/L. Rakk on 1 cm laiune. See ongi kogu seadus. Tööriist kuvab selle korrutise rea Neelduvus A all.
  
  $A = ε c ℓ = 6220 L mo l^{- 1} c m^{- 1} \cdot 4.0000 \times 1 0^{- 4} mol L^{- 1} \cdot 1 cm = 2.4880$
2. Neelduvus on defineeritud kui −log₁₀T, seega pööra tehe ümber. Küvetist pääseb välja umbes kolm footonit tuhandest. Kõik, mida analüütik väitma hakkab, tugineb instrumendi võimele eristada seda kahest või neljast tuhandest.
  
  $T = 1 0^{- A} = 1 0^{- 2.4880} = 3.2509 \times 1 0^{- 3} = 0 . 33%$
3. Nüüd lisa sellele määramatus. Instrument mõõdab suurust T. Kirjuta c lahti T kaudu ja leia tuletis. Nii ε kui ka ℓ on olemas tuletises ja kontsentratsioonis endas, seega need taanduvad välja. Suhteline määramatus sõltub ainult näidust. See ei sõltu sellest, mis on küvetis või kui lai see küvett on.
  
  $c = \frac{- lo g _{10} T}{ε ℓ} ⟹ \frac{d c}{d T} = \frac{- 1}{ε ℓ T ln 10} ⟹ \frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{ε ℓ T ln 10} \cdot \frac{ε ℓ ln 10}{ln ( 1/ T )} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )}$
4. Korralik laualabori seade on täpne umbes 0,5% ulatuses läbilaskvuse skaalast, seega σ_T = 0,005. Avaldise lahtikirjutamine A, mitte T kaudu lubab kasutada arvu, mille andis juba esimene samm. Tööriist kuvab rea Kontsentratsiooni määramatus all 26,85%. Lõppvastus on seega 400 µmol/L pluss-miinus 107.
  
  $\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T} 1 0 ^{A}}{A ln 10} = \frac{0 . 005 \cdot 307 . 61}{5 . 72883} = 0.26845400 \cdot 0.26845 = 107 μ mol L^{- 1}$
5. Kus oleks see olnud kõige väiksem? Me tahame, et nimetaja T ln(1/T) oleks võimalikult suur. Sellel on vaid üks maksimum. Tuletis annab tulemuseks −ln T − 1, mis on null kohal T = 1/e. Parim võimalik kättesaadav näit on seega A = log₁₀e = 0,4343. Määramatus on seal e·σ_T = 1,36%. Analüütiku näit maksis sellest 19,75 korda rohkem.
  
  $\frac{d}{d T} (- T ln T) = - ln T - 1 = 0 ⟹ T = \frac{1}{e} = 0.36788, A = lo g_{10} e = 0.4343, e σ_{T} = 0.013591 \frac{0 . 26845}{0 . 013591} = 19.75$
6. Liiga heleda näidu lugemine maksab 2,01× kohal A = 0,1. Liiga tumeda lugemine maksab 53,26× kohal A = 3. Need kaks näitu on optimumist sarnasel kaugusel, kuid nende täpsus pole kaugeltki võrreldav. See on põhjus, miks veapaneel on joonistatud logaritmilisele teljele. Samal põhjusel on labori antav nõuanne alati pigem lahjendada kui kontsentreerida.
  
  $A 0.1000 0.2000 0.4343 0.7000 1.0000 1.5000 2.0000 2.4880 3.0000 T 79 . 43% 63 . 10% 36 . 79% 19 . 95% 10 . 00% 3 . 16% 1 . 00% 0 . 33% 0 . 10% σ_{c} / c 2 . 73% 1 . 72% 1 . 36% 1 . 55% 2 . 17% 4 . 58% 10 . 86% 26 . 85% 72 . 38% \times floor 2.01 1.27 1.00 1.14 1.60 3.37 7.99 19.75 53.26$
7. Seega lahjenda. Tehe 2,4880 ÷ 0,4343 = 5,73 viib proovi kontsentratsioonini 69,82 µmol/L. See on näitaja rea Optimaalne kontsentratsioon all. Vaid üks pipeteerimissamm ja täpselt sama instrument annab 19,75 korda täpsema vastuse. Lahjendusel on loomulikult omaenda määramatus, mis lisandub ruutude summana. See peaks olema halvem kui 26,8%, et muuta säärane vahetus halvaks tehinguks.
  
  $\frac{A}{lo g _{10} e} = \frac{2 . 4880}{0 . 4343} = 5.73, c_{opt} = \frac{lo g _{10} e}{ε ℓ} = \frac{0 . 4343}{6220} = 6.982 \times 1 0^{- 5} mol L^{- 1} = 69.82 μ mol L^{- 1} 0.2684 5^{2} - 0.01359 1^{2} = 0.268$
8. Midagi sellest aga polnud ekraanil. Hajuvalguse 0,1% juures teatas instrument näidu 2,3720. See jääb 4,7% alla neelduvusele, mille keemia tootis. Olenemata küvetti pandust poleks seade suutnud näidata rohkemat kui 3,0004. Analüütiku 2,49 oli seega juba kahe vea sügavusel, isegi enne määramatuse arvesse võtmist.
  
  $A_{meas} = - lo g_{10} \frac{1 0 ^{- A} + s}{1 + s} = - lo g_{10} \frac{3 . 2509 \times 1 0 ^{- 3} + 0 . 001}{1 . 001} = 2.3720, 1 - \frac{2 . 3720}{2 . 4880} = 4 . 7%, A_{m a x} = lo g_{10} \frac{1 . 001}{0 . 001} = 3.0004$
9. Monokromaator ei edasta ainult ühte lainepikkust. Oletame, et pool kiirest paikneb seal, kus ε on 20% madalam. Lõpliku laiusega pilu teeb neeldumispiigi nõlval just seda. Detektor liidab kahe osa intensiivsused. Logaritm võetakse vaid korra, pärast liitmist, seega näiv neelduvus langeb allapoole intensiivsusega kaalutud keskmist. Nominaalse A = 1 juures loeb instrument 0,8886. Keskmine oleks aga 0,9000. Nominaalse 2 juures loeb see 1,7555 ja keskmine on 1,8000. Puudujääk kasvab koos kontsentratsiooniga. Kalibreerimisjoon paindub kontsentratsioonitelje poole, selle asemel et lihtsalt nihkuda. Kinnita ühe punkti kalibreering optimumile ja kasuta seda kohal A = 3. Tulemuseks saadud kontsentratsioon on 3,03% madalam. Midagi sellest pole ülaloleval paneelil. Teine ε ja kiire pooleks jagamine vajavad kolme lisajuhtnuppu, mida sellel lehel pole.
  
  $A_{app} = - lo g_{10} [\frac{1}{2} 1 0^{- A} + \frac{1}{2} 1 0^{- 0.8 A}] : A = 1 \to 0.8886 (mean 0.9000), A = 2 \to 1.7555 (mean 1.8000)$
Vastus

400 µmol/L pluss-miinus 107. Aritmeetika oli täiesti õige, aga näit asus vales kohas: 0,33% kiirest läbis raku. Kontsentratsiooni määramatus oli 26,85%. See on 19,75 korda suurem määramatus, kui sama instrument oleks andnud kohal A = 0,4343.

Lahjendamine 5,73× tasemeni 69,82 µmol/L annab tulemuseks 69,82 ± 0,95. See korrutub tagasi kujule 400 ± 5,4. Sama proov, sama instrument, sama pärastlõuna.

Seda 2,4880 aga polnud tegelikult kunagi ekraanil. Hajuvalgus oli sellest võtnud 4,7% juba enne, kui analüütik jõudis üldse midagi lugeda.

$\frac{σ _{c}}{c} = \frac{σ _{T}}{T ln ( 1/ T )} minimised at T = \frac{1}{e} ⟹ A = lo g_{10} e = 0.4343$

Allikad (5)

The concentration half of the law, and the paper the name comes from: August Beer, "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten", Annalen der Physik 162(5), 78–88, 1852. doi:10.1002/andp.18521620505
Who actually wrote what, which the usual attribution gets wrong: Heinz G. Pfeiffer and Herman A. Liebhafsky, "The origins of Beer's law", Journal of Chemical Education 28(3), 123, 1951. doi:10.1021/ed028p123
The photometric error curve that carries their names: F. Twyman and G. F. Lothian, "Conditions for securing accuracy in spectrophotometry", Proceedings of the Physical Society 45(5), 643–662, 1933. doi:10.1088/0959-5309/45/5/304
An openly readable derivation of the same result, in the same notation: "13.3: Effect of Noise on Transmittance and Absorbance Measurements", Instrumental Analysis, Chemistry LibreTexts (CC BY-NC-SA 4.0).
Where the 6,220 L mol⁻¹ cm⁻¹ for NADH at 340 nm comes from: B. L. Horecker and Arthur Kornberg, "The extinction coefficients of the reduced band of pyridine nucleotides", Journal of Biological Chemistry 175(1), 385–390, 1948. doi:10.1016/S0021-9258(18)57268-9

42Mathi meeskond · Kontrollitud avaldatud allikate põhjal. Parandused on teretulnud.